Inmunodifusión
doble (Ouchterlony)
Objetivo:
En esta práctica vamos a intentar determinar la identidad de un
anticuerpo frente a distintos antígenos. En un gel de agarosa tamponado, el Ag
y el Ac se cargan en unos pocillos perforados. Después de una difusión de entre
12 y 48 horas, el reconocimiento del Ag por el Ac se detecta por la formación
de una línea de inmunoprecipitación entre los pocillos.
Materiales:
-
Cámara húmeda (la fabricamos con cubetas y papel de filtro humedecido)
-
Agarosa
-
Pipetas y material de pipeteo
-
Micropipetas y puntas de pipeta
-
Placas de Petri pequeñas
-
Cortadores para pocillos
-
Plantilla de corte para pocillos
-
Antisuero (Anticuerpo)
-
Suero total (Antígeno)
-
Albúmina (Antígeno)
- IgG
(Antígeno)
-
Tampón PBS
Procedimiento:
-1: Lo
primero que tenemos que hacer es
preparar la placa con Agar.
1.1.Para ello calentamos la solución de
agarosa al 1% en tampón PBS en el microondas hasta su disolución.
1.2.Dejamos que enfríe hasta unos 60
grados y vertemos la disolución en las placas, dejándolas reposar hasta que
solidifiquen
-2:
Ahora, empleando el cortador de pocillos
y unas pinzas, hacemos los agujeros con la usando la plantilla que incluye el
protocolo. Hacemos 1 en el centro y 4 alrededor, separados entre si
-3:
Después aplicamos 30 microlitros del tubo con antisuero (A) en el pocillo
central de cada una de las tres placas del grupo, luego echaremos las
cantidades correspondientes ( 30 microlitros en cada pocillo) de los tubos con
suero entero (B), con albúmina (C) y con IgG (D)
-4: A
continuación colocamos a cada placa la tapa ya rotulada y lo sellamos.La
metemos en la cámara húmeda, donde estarán de 24- 48 horas.
Resultado:
Cuando ya han pasado el
periodo de tiempo estipulado en la cámara húmeda es hora de sacarla y ver los
resultados obtenidos. Podemos ver que la práctica ha salido correctamente ya
que cuando le ponemos un foco de luz por debajo se puede ver las líneas
trasparente que han surgido por el movimiento de la muestra y la unión entre
Ag-Ac
Galería:
