Inmunodifusión doble (Ouchterlony)

Objetivo:

 En esta práctica vamos a intentar determinar la identidad de un anticuerpo frente a distintos antígenos. En un gel de agarosa tamponado, el Ag y el Ac se cargan en unos pocillos perforados. Después de una difusión de entre 12 y 48 horas, el reconocimiento del Ag por el Ac se detecta por la formación de una línea de inmunoprecipitación entre los pocillos.

Materiales:

- Cámara húmeda (la fabricamos con cubetas y papel de filtro humedecido)

- Agarosa

- Pipetas y material de pipeteo

- Micropipetas y puntas de pipeta

- Placas de Petri pequeñas

- Cortadores para pocillos

- Plantilla de corte para pocillos

- Antisuero (Anticuerpo)

- Suero total (Antígeno)

- Albúmina (Antígeno)

- IgG (Antígeno)

- Tampón PBS

Procedimiento:

-1: Lo primero que tenemos que hacer  es preparar la placa con Agar.

     1.1.Para ello calentamos la solución de agarosa al 1% en tampón PBS en el microondas hasta su disolución.

     1.2.Dejamos que enfríe hasta unos 60 grados y vertemos la disolución en las placas, dejándolas reposar hasta que solidifiquen

-2: Ahora, empleando el  cortador de pocillos y unas pinzas, hacemos los agujeros con la usando la plantilla que incluye el protocolo. Hacemos 1 en el centro y 4 alrededor, separados entre si

-3: Después aplicamos 30 microlitros del tubo con antisuero (A) en el pocillo central de cada una de las tres placas del grupo, luego echaremos las cantidades correspondientes ( 30 microlitros en cada pocillo) de los tubos con suero entero (B), con albúmina (C) y con IgG (D)

-4: A continuación colocamos a cada placa la tapa ya rotulada y lo sellamos.La metemos en la cámara húmeda, donde estarán de 24- 48 horas.

 Resultado:

 Cuando ya han pasado el periodo de tiempo estipulado en la cámara húmeda es hora de sacarla y ver los resultados obtenidos. Podemos ver que la práctica ha salido correctamente ya que cuando le ponemos un foco de luz por debajo se puede ver las líneas trasparente que han surgido por el movimiento de la muestra y la unión entre Ag-Ac

 Galería: