Inmunoelectroforesis

Inmunoelectroforesis

Objetivo:

 En esta práctica vamos a realizar una electroforesis, una técnica muy empleada en el ámbito de la inmunología. Con esta vamos a separar y determinar una mezcla de proteínas

 Materiales:

-       Aparato de electroforesis

-       Fuente de alimentación

-       Micropipetas y puntas para estas

-       Baño de agua

-       Portaobjetos

-       Agua destilada

-       Probeta

-       Vaso de precipitado

-       Estufa incubadora

 Procedimiento:

  1. Primero tenemos que preparar el tampón de electroforesis; mezclando el tampón concentrado (40mL) con el agua destilada (960mL)

 2. En segundo lugar debemos hacer el gel de agarosa , hechando los polvos de agarosa y calentando

 3. Luego hacemos los pocillos empleando un corta pocillos

 4. Ahora quitamos los tapones de gel de agarosa y transferimos la bandeja del gel al aparato de electroforesis

 5. A continuación agregamos tampón hasta que las mechas queden sumergidas en el tampón y nos aseguramos que la mecha esta en contacto con el gel

 6. Después, cargamos los pocillos con los antigenos y suministramos corriente a la intensidad y tiempo estipulada, para lograr que las proteínas imigren

 7. Una vez ya haya concluido la imigración retiramos la corriente y la bandeja de la cubeta de electroforesis y la ponemos en una superficie nivelada

 8. Luego añadimos los anticuerpo a cada canal correspondiente

 9. Por último colocamos la bandeja en una cámara de humedad y le concedemos 24-48H

 Resultado:

 Una vez acabado esta práctica podemos leer los resultados y vemos la formación de arcos de precipitado blanco en el gel. Se han formado 4 arcos los cuales corresponden a las albúminas que tiene el suero total.

Galería:

E.L.I.S.A.- Inmunodoting

      E.L.I.S.A.- Inmunodoting

 Objetivo:

 En esta práctica vamos a detectar la presencia o ausencia de IgGs bovinas en varias muestras problema de suero mediante ensayo de inmunodoting

 Materiales:

-       Placas de análisis

-       Anticuerpos anti-IgG

-       Tampón fosfato

-       Cubeta de incubación

-       Pipeta Pasteur

-       Control + y -

-       Muestra de suero sanguíneo

 Procedimiento:

1.    Primero tenemos que sacar la placa de la bolsa y aplicar 5 μL de la muestra y controles en cada ventana de la placa y dejar que se seque al aire

2.    Luego preparamos la solución de bloqueo, vertiendo el contenido la ovoalbúmina sobre el tampón fosfato salino, lo mezclamos hasta conseguir una mezcla homogénea

3.    Después metemos la placa de microcelulosa en la cubeta y la cubrimos con la disolución de bloqueo y lo dejamos así 30 mins. y tras pasar este tiempo lo tenemos que lavar con abundante agua y evitar que se seque

4.    A continuación, quitamos el agua sobrante y añadimos 20μL del anticuerpo conjugado e incubamos durante 10 mins

5.    Ahora lavamos cada pocillo con mucha agua, sacudimos y la metemos en la cubeta de coloración

6.    Por último añadimos 50 μL  de sustrato cromógeno y le concedemos unos minutos, mientras que lo movemos continuamente. Detenemos la reacción de coloración cuando veamos el control positivo claramente, lavando con abundante agua

Resultado:

 Tras concluir esta práctica podemos ver que en la reacción positiva aparece un punto morado en el centro del pocillo. Si la muestra no tiene IgG bovinas  el anticuerpo no es retenido y no produciría color alguno. Una vez que estan unido el antígeno-anticuerpo, el complejo puede ser detectado por una reacción de oxidorreducción

 Galería:

TSH-ELISA

                    TSH-ELISA

 Objetivo:

 En esta práctica vamos a emplear un test inmunoenzimático para poder determinar y cuantificar las hormonas estimulante del tiroides (TSH)

Materiales:

-       Lector de placas microtitter

-       Agua

-       Pipetas

-       Suero como muestra

Reactivos:

-       Placa de micropocillos cubiertos con Ac monoclonal murino anti- TSH.

-       Set de patrones liofilizados: 0,0,1,0,5,2,5y 10

-       Conjugado enzimático (13mL)

-       Sustrato TMB (11 mL)

-       Solución de parada: HCl 1 N (11 mL)

 Procedimiento:

 1. En primer lugar,pipeteamos 100 μL de los patrones, del control y de la muestra en los pocillos correspondientes

 2. Luego agregamos 100 μL de conjugado en cada pocillo, mezclamos y lo dejamos incubar durante 60 mins

 3. Pasado el tiempo de incubación volcamos el contenido de los pocillos y lavamos los pocillos con agua destilada hasta llenarlos. Repetir el lavado cinco veces

 4. Tras el último lavado, eliminamos el contenido de agua de los pocillos sacudiéndolos contra un papel absorbente

 5. A continuación agregamos 100 μL de solución TMB (sustrato cromogénico).Y vemos que el color vira a azul

 6. Ahora tenemos que Incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos

 7. Después, detenemos la reacción añadiendo 100 μL de solución de parada y mezclamos con cuidado durante 30 segundos,podremos apreciar que el color vira completamente a amarillo

8. Por último determinar la absorbancia a 450 nm con un lector de micropocillos durante los 15 minutos siguientes

 Galería:

TEST DE OVULACIÓN

            TEST DE OVULACIÓN

 Objetivo:

 En esta práctica vamos a realizar una técnica de inmunoensayo  visual rápido, para poder detectar si la mujer está en sus días de ovulación. A través de la detección de la hormona luteinizante humana (hLH), hormona que varía en función de la fase de la ovulación

 Materiales:

-      Test de ovulación

-      Orina a modo de muestra

-      Recipiente donde estará la muestra

 Procedimiento:

1.   Primero tenemos que la orina y preparar el centro de trabajo

2.   Luego metemos el extremo del test, que esta preparado para ello

3.   A continuación le concedemos unos 5 mins para que se forme las reacciones pertinentes

4.   Por último una vez que haya pasado este tiempo leeremos el resultado

 Resultado:

 Tras haber acabado esta práctica podemos ver que que se han formado una línea en el rectángulo del resultado, lo que significa que es negativo por lo que la mujer no está ovulando

Galería:

Inmunodifusión doble (Ouchterlony)

Objetivo:

 En esta práctica vamos a intentar determinar la identidad de un anticuerpo frente a distintos antígenos. En un gel de agarosa tamponado, el Ag y el Ac se cargan en unos pocillos perforados. Después de una difusión de entre 12 y 48 horas, el reconocimiento del Ag por el Ac se detecta por la formación de una línea de inmunoprecipitación entre los pocillos.

Materiales:

- Cámara húmeda (la fabricamos con cubetas y papel de filtro humedecido)

- Agarosa

- Pipetas y material de pipeteo

- Micropipetas y puntas de pipeta

- Placas de Petri pequeñas

- Cortadores para pocillos

- Plantilla de corte para pocillos

- Antisuero (Anticuerpo)

- Suero total (Antígeno)

- Albúmina (Antígeno)

- IgG (Antígeno)

- Tampón PBS

Procedimiento:

-1: Lo primero que tenemos que hacer  es preparar la placa con Agar.

     1.1.Para ello calentamos la solución de agarosa al 1% en tampón PBS en el microondas hasta su disolución.

     1.2.Dejamos que enfríe hasta unos 60 grados y vertemos la disolución en las placas, dejándolas reposar hasta que solidifiquen

-2: Ahora, empleando el  cortador de pocillos y unas pinzas, hacemos los agujeros con la usando la plantilla que incluye el protocolo. Hacemos 1 en el centro y 4 alrededor, separados entre si

-3: Después aplicamos 30 microlitros del tubo con antisuero (A) en el pocillo central de cada una de las tres placas del grupo, luego echaremos las cantidades correspondientes ( 30 microlitros en cada pocillo) de los tubos con suero entero (B), con albúmina (C) y con IgG (D)

-4: A continuación colocamos a cada placa la tapa ya rotulada y lo sellamos.La metemos en la cámara húmeda, donde estarán de 24- 48 horas.

 Resultado:

 Cuando ya han pasado el periodo de tiempo estipulado en la cámara húmeda es hora de sacarla y ver los resultados obtenidos. Podemos ver que la práctica ha salido correctamente ya que cuando le ponemos un foco de luz por debajo se puede ver las líneas trasparente que han surgido por el movimiento de la muestra y la unión entre Ag-Ac

 Galería:

Estreptolisina O liofilizada

Objetivo:

 En esta práctica vamos a emplear la técnica de la estreptolisina el cual tiene carácter inmunogénico de la SLO que permite valorar la extensión de una infección estreptocócica. La Estreptolisina O (SLO) liofilizada, que es un purificado procedente del cultivo de Estreptococos β-hemolíticos . Se trata de un producto estandarizado para la determinación cuantitativa del título de antiestreptolisina O, por la técnica de inhibición de la hemólisis. Donde, la presencia de un aglutinado indica que no hay cantidad suficiente de anticuerpos por lo que la formación de un precipitado indica la presencia de anticuerpos, que impiden la hemólisis de los glóbulos rojos al unirse el anticuerpo con el antígeno.

Materiales:

- Estreptolisina O liofilizada

- Tampón fosfato pH 6,5

- Suero

- Agua destilada

- Hematíes grupo O (suspensión al 3%)

- Placa de microtiter en U

- Pipetas automáticas y puntas

Procedimiento:

-1: Primero tenemos que rehidratar con agua destilada el vial de estreptolisina liofilizada, mezclándolo suavemente

-2: Ahora vamos a preparar las siguientes diluciones del suero del paciente:

0,2 ml suero + 1,8 ml tampón (1:10) 0,1 ml suero + 2,4 ml tampón (1:25)

-3: A continuación realizamos los siguientes pasos:

     3.1. Dispensamos 50 μL de tampón en cada pocillo de dos filas de la placa.

     3.2. Añadimos 50 μL de la dilución 1:10 al primer pocillo de la fila A.

     3.3. Añadimos 50 μL de la dilución 1:25 al primer pocillo de la fila B.

     3.4. A partir del primer pocillo efectuamos sucesivas diluciones con la ayuda de una pipeta, por pases de 50 μL.

     3.5. Añadir 25 μL de disolución de estreptolisina O rehidratada a todos los pocillos excepto en el último (nº 10) de la fila B.

     3.6. Agitamos suavemente e incubamos 15 min/37º C.

     3.7. Añadimos 25 μL de suspensión de hematíes al 3% a cada pocillo.

     3.8. Agitamos suavemente e incubamos 45 min/37º C, agitando después de los primeros 15 min.

     3.9. Dejar sedimentar durante unos 50-60 min a temperatura ambiente.

Resultado:

 Tras haber realizado estos procedimientos, vemos que hemos hecho correctamente todos los pasos y que hemos logrado ser meticulosos. Pese a algunas dificultades que se nos presentaron; pero pudimos solventarlas y rehacerla bien

 Galería:

Antígenos bacterianos

Objetivo:

 En esta práctica vamos a intentar realizar una técnica de aglutinación en tubo para la detección y semicuantificación de anticuerpos anti-Salmonella, Brucella y Proteus en suero humano. Los reactivos (suspensiones bacterianas coloreadas y estandarizadas), aglutinan en presencia del anticuerpo homólogo correspondiente en las muestras ensayadas.

 Materiales:

- Micropipetas

- Puntas de pipeta

- Tubos

- Gradilla

- Reactivos con Ag bacterianos

- Control positivo y negativo

- Solución salina fisiológica

Procedimiento:

-1: Primero tenemos que preparar 6 tubos para S. typhi “O” y otros 6 tubos para S.typhi “H”. Lo que haremos es una serie de diluciones de la muestra, para semicuantificarla.

-2: Después añadiremos una gota de antígeno a cada tubo de los 6 tubos (diferenciando los tubos de S.typhi “O” y S.typhi “H”).

-3: A continuación agitamos para homogeneizar e incubamos a 37ºC durante 24 horas.

Resultados:

 El título es el último tubo que presenta aglutinación. El control positivo debe presentar aglutinación y el control negativo no, por lo que se vemos todo el líquido coloreado.

Galería: